Il naquit en 1541 à Diecimo, dans la République de Lucques, en Toscane. Fils de pharmacien, il le devint lui-même, et se rendit à Lucques en 1567 pour y exercer. Toutefois, ayant rejoint un groupe dirigé par un dominicain, il abandonna la pharmacie et étudia la théologie ; il fut ordonné prêtre en 1572. Il se consacra tout d’abord à la formation chrétienne des jeunes, puis fonda une compagnie qui devint la congrégation des Clercs de la Mère de Dieu. Il s’attachait notamment à la diffusion des réformes du concile de Trente dans les paroisses.

Expulsé de la République de Lucques en raison de sa volonté de réforme, il fut accueilli à Rome par le pape Clément VIII pour qu’il y réforme la vie religieuse. Il prit alors saint Philippe Néri comme père spirituel. Il répandit le culte marial et la dévotion au Saint-Sacrement, notamment par la pratique des Quarante Heures. Par ailleurs, il fonda le séminaire pour la Propagation de la Foi, destiné à la formation des séminaristes indigènes envoyés par les missionnaires.

Jean Leonardi mourut à Rome le 9 octobre 1609 durant une épidémie de grippe, alors qu’il se dévouait pour soigner ses frères. Les constitutions de son ordre furent approuvées par Paul V en 1614. Il fut canonisé par Pie XI le 17 avril 1938. Benoît XVI, qui le déclara saint patron des pharmaciens le 8 août 2006, lui dédia son audience générale du 7 octobre 2009 : « Conquis par le Christ comme l’apôtre Paul, il indiqua à ses disciples, et il continue de nous indiquer à tous, l’idéal christocentrique pour lequel “il faut se dépouiller de chaque intérêt personnel et ne voir que le service de Dieu”, en ayant “devant les yeux de l’esprit uniquement l’honneur, le service et la gloire du Christ Jésus crucifié”. A côté de la face du Christ, il fixa son regard sur le visage maternel de Marie. Celle qu’il élut Patronne de son ordre fut pour lui maîtresse, sœur, mère, et il fit l’expérience de sa constante protection. Que l’exemple et l’intercession de cet “homme de Dieu fascinant” soit, en particulier en cette Année sacerdotale, un appel et un encouragement pour chaque prêtre et pour chaque chrétien à vivre avec passion et enthousiasme sa propre vocation. »