Né vers l’an 480, dans une noble famille de Nursie, il reçut une bonne instruction avant de partir à Rome pour y poursuivre ses études vers 495. Choqué par la vie mondaine et la dépravation des mœurs de cette ville, il la quitta rapidement, en quête de Dieu, pour mener une vie érémitique dans les environs de Subiaco. Comme le rapporte saint Grégoire le Grand, il était « plus avide de souffrir les maux de ce monde que de jouir de ses louanges, d’endurer les travaux pour Dieu plutôt que de s’élever par les faveurs de la vie ».
Sa réputation de sainteté était déjà grande : vers 510, les moines de Vicovaro lui demandèrent de devenir leur père abbé. Benoît voulut réformer cette communauté qui ne respectait plus la règle de saint Pacôme. Regrettant le choix de cet abbé trop saint, les moines versèrent du poison dans sa coupe de vin ; cette coupe se brisa lorsque Benoît la bénit. Il quitta alors Vicovaro et reprit la vie érémitique.
Rejoint par des disciples fidèles, il se décida à fonder une communauté à Subiaco. Vers 429, faisant face à la jalousie d’un prêtre local, Benoît partit avec plusieurs moines pour fonder une abbaye au Mont-Cassin. Il laissa Subiaco à la charge d’un de ses disciples, saint Maur. En tout, Benoît fonda une douzaine de monastères. Pour organiser la vie en communauté, il établit une règle, connue comme la Règle de saint Benoît, dont le principe fondamental est « qu’en toutes choses Dieu soit glorifié ». Il aida aussi sa sœur, sainte Scholastique, à fonder une communauté féminine non loin du Mont-Cassin.
Benoît mourut le 21 mars 547, peu de temps après sa sœur. A ses moines, il avait prédit quelques temps plus tôt le jour de sa mort. Il est considéré comme le père du monachisme ; le 24 octobre 1964, il fut déclaré saint patron de l’Europe. Saint Grégoire le Grand écrivit sur lui : « L’homme de Dieu qui brilla sur cette terre par de si nombreux miracles, ne brilla pas moins par l’éloquence avec laquelle il sut exposer sa doctrine. »
Dans son audience générale du 9 avril 2008, Benoît XVI, qui avait placé son pontificat sous le patronage de saint Benoît, déclara à propos de sa Règle : « En raison de sa mesure, de son humanité et de son sobre discernement entre ce qui est essentiel et secondaire dans la vie spirituelle, elle a pu conserver sa force illuminatrice jusqu’à aujourd’hui. (…) Sans cette sève vitale, l’homme reste exposé au danger de succomber à l’antique tentation de vouloir se racheter tout seul. (…) Le grand moine demeure un véritable maître à l’école de qui nous pouvons apprendre l’art de vivre le véritable humanisme. »