Originaire d’Ephèse, où il naquit dans les premières années du Ier siècle, il se convertit et fut l’un des 70 disciples choisis par Jésus-Christ pour évangéliser. Il fut évêque de Colophon, en Asie Mineure, puis de Corinthe. Il fut un proche collaborateur de saint Paul, notamment à Ephèse ; lorsque ce dernier fut emprisonné à Rome, Onésiphore se rendit à ses côtés pour lui porter assistance. On lit dans la deuxième épître à Timothée :

« Que le Seigneur répande sa miséricorde sur la maison d’Onésiphore ; car souvent il m’a réconforté, et il n’a pas rougi de mes fers. Au contraire, dès son arrivée à Rome, il m’a cherché avec un grand empressement, et m’a trouvé. Que le Seigneur lui donne d’obtenir miséricorde auprès du Seigneur en ce jour-là ! Tu sais mieux que personne tous les services qu’il m’a rendus a Ephèse. »

Il semble qu’Onésiphore se rendit ensuite dans l’Hellespont, à côté du détroit des Dardanelles, où il continua sa mission d’évangélisation. C’est là qu’il trouva la mort en martyr, dans la ville de Parium, dans la deuxième moitié du Ier siècle.