Il naquit à Rome vers 540 ; son bisaïeul était le pape saint Félix III. D’abord préfet de la ville de Rome en 572, il décida vers 575 de se consacrer à Dieu, transforma une demeure familiale en monastère et se fit moine selon la règle de saint Benoît.

Ordonné diacre par le pape Pélage II, il fut envoyé à Constantinople comme apocrisiaire (ambassadeur permanent). En Orient, il défendit la vraie doctrine contre les hérésies qui y sévissaient ; il y résida pendant une dizaine d’années, jusqu’à être rappelé à Rome vers 586, où il reprit sa vie monastique et fut conseiller du pape.

Le 5 février 590, le pape Pélage II mourut. Grégoire fut alors élu pour le remplacer ; il refusa au départ cette charge, mais fut finalement sacré le 3 septembre 590. Rome était alors menacé par les envahisseurs Lombards : il obtint la conversion de leur roi, jusqu’alors arien, et ramena la paix. Il s’attira à ce titre l’hostilité de l’empereur d’Orient, à qui il écrivit : « J’attends plus de la miséricorde de Dieu, de qui vient la justice, que de votre piété. » Il lutta par ailleurs contre diverses hérésies, telles que le donatisme et la simonie.

Le pape Grégoire Ier prit aussi la défense des populations rurales, s’attacha à conserver le patrimoine de l’Eglise, propagea la règle de saint Benoît parmi les moines. Vers 596, il envoya en Bretagne (Angleterre) Augustin de Cantorbéry, accompagné de 40 moines, pour évangéliser ces îles. Il s’occupa encore des rites et du culte, composa l’antiphonaire et fonda une école pour les chantres : on parle depuis de chant grégorien.

Après avoir mené une vie austère, Grégoire Ier mourut le 12 mars 604, laissant un grand nombre d’homélies, de commentaires et autres ouvrages d’une importance capitale pour l’histoire ecclésiastique. L’importance de son œuvre lui valut le titre de « Grand ». Dans une de ses catéchèses, le pape Benoît XVI dit de lui : « Son désir fut véritablement de vivre en moine, dans un entretien constant avec la Parole de Dieu, mais par amour de Dieu il sut se faire le serviteur de tous à une époque pleine de troubles et de souffrances, se faire “serviteur des serviteurs”. C’est précisément parce qu’il le fut qu’il est grand et qu’il nous montre également la mesure de la vraie grandeur. »